1、實(shí)驗(yàn)原理
蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬(wàn)別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。
（1）凝膠色譜法（分配色譜法）：
①原理：分子量大的分子通過(guò)多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；分子量小的分子穿過(guò)多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。
②凝膠材料：多孔性，多糖類(lèi)化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。
③分離過(guò)程：
混合物上柱→洗脫→大分子流動(dòng)快、小分子流動(dòng)慢→收集大分子→收集小分子
洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。
④作用： 分離蛋白質(zhì)，測(cè)定生物大分子分子量，蛋白質(zhì)的脫鹽等。
（2）緩沖溶液
①原理：由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成（如H2CO3—NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等），調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。
②緩沖液作用：抵制外界酸、堿對(duì)溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。
(3）凝膠電泳法：
①原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。
②分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。
③分離過(guò)程：在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。
2、實(shí)驗(yàn)步驟
（1）樣品處理
① 紅細(xì)胞的洗滌
洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時(shí)采用低速離心機(jī)短時(shí)間離心分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒(méi)有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。
②血紅蛋白的釋放
在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。
注：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。
（2）粗分離
①分離血紅蛋白溶液
將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無(wú)色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過(guò)濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。
②透析
取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。
（3）純化：調(diào)節(jié)緩沖液面→加入蛋白質(zhì)樣品→調(diào)節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì)
（4）純度鑒定——SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
掃我聯(lián)系