植物基因組DNA提取實驗需要使用離心機?具體操作步驟？提取植物組織基因組DNA
一、材料
幼嫩葉子。
二、設備
移液器，冷凍高速離心機，臺式高速離心機，水浴鍋，陶瓷研缽，50ml離心管（有蓋）及5ml和1.5ml離心管，彎成鉤狀的小玻棒。（這時選擇設備的時候注意選擇那種通用性強的，可以一機配多種轉子的離心機，可以大大的降低設備采購成本，比如說TG16臺式高速離心機系列，就有16種轉子可供選擇，有6*50ml（角轉子），16*5ml(角轉子），12*1.5/2ml微量角轉子，一款機型都可以配全，省事省錢，方便使用，帶冷凍的話選擇TGL16臺式高速冷凍離心機系列或者TGL20臺式高速冷凍離心機系列即可.三、試劑
1、提取緩沖液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。
2、提取緩沖液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸鈉，6.0gPVP，240ul巰基乙醇，加水至300ml。
3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇
4、 RnaseA母液
5、其它試劑：液氮、異丙醇、TE緩沖液，無水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。
四、操作步驟：
1. 在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液Ⅰ, 60℃水浴預熱。
2. 幼苗或葉子5-10g, 剪碎, 在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預熱的離心管中, 劇烈搖動混勻, 60℃水浴保溫30-60分鐘(時間長,DNA產(chǎn)量高), 不時搖動。
3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 顛倒混勻(需帶手套, 防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10分鐘, 使水相和有機相分層(必要時可重新混勻)。
4. 室溫下5000rpm離心5分鐘。
5. 仔細移取上清液至另一50ml離心管,加入1倍體積異丙醇,混勻,室溫放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。
6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團,在干凈吸水紙上吸干,轉入含TE的離心管中,DNA很快溶解于TE。
7. 如DNA不形成絮狀沉淀,則可用5000rpm離心5分鐘, 再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀,往往難溶解于TE,可在60℃水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。
8. 將DNA溶液3000rpm離心5分鐘, 上清液倒入干凈的5ml離心管。
9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分鐘, 除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。
10. 加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇,混勻,-20℃放置20分鐘左右,DNA形成絮狀沉淀。
11. 用玻棒撈出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干凈吸水紙上吸干。
12. 將DNA重溶解于1ml TE, -20貯存。
13. 取2μl DNA樣品在0.7% Agarose膠上電泳, 檢測DNA的分子大小。同時取15μl稀釋20倍, 測定OD260/OD280, 檢測DNA含量及質(zhì)量。
[注意] 5g樣品可保證獲得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。
掃我聯(lián)系