一、 實驗目的
1、掌握酵母RNA提取的方法。
2、了解核酸的組成。
3、掌握鑒定核酸組分的方法和操作。
二、 實驗原理
酵母核酸中RNA含量較多，DNA則少于2%。RNA可溶于堿性溶液，當堿被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到RNA制品。但是用堿液提取的RNA有不同的降解。RNA含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸等組分，加入硫酸煮沸可使其水解，從水解液中可以測出上述組分的存在(見實驗內(nèi)容)
三、 實驗步驟
1、 用托盤天平稱1g干酵母于研缽中，加入少許石英砂，再加入2ml 0.04mol/LNaOH溶液，在研缽中充分研磨至少5min。
2、 再加4ml 0.04mol/LNaOH溶液于勻漿液中，混勻后，將勻漿液轉(zhuǎn)移到大試管中，再用4ml 0.04mol/LNaOH溶液洗滌研缽，洗滌液并入勻漿液中。
3、 將大試管小心在沸水浴中加熱30min，冷卻后倒入離心管中，與另一組離心管在托盤天平上平衡，然后兩組的離心管對稱地放入離心機中，2000r/min下離心15min。
4、 吸取10ml酸性乙醇溶液于小燒杯中，將離心管上清液小心倒入小燒杯中，邊倒入邊攪拌，直到RNA沉淀完全。
5、 將小燒杯中的液體倒入2個干凈的離心管，平衡、離心（2000r/min）3min。
6、 棄去兩離心管上清液，各離心管中加入95%乙醇2.5ml，振蕩、混勻、平衡、離心（2000r/min）3min。
7、 棄去兩離心管上清液，各離心管加入3ml 1.5mol/L硫酸，混勻、倒入同一個大試管中，貼上標簽，放在試管架上，備用。
8、 將水解液在沸水浴中加熱至少10min，使沉淀RNA充分水解。
9、 取一支試管A，加入1ml 0.1mol/L硝酸銀溶液，再逐滴加入濃氨水至沉淀消失，然后加入1ml水解液放置片刻，觀察有無白色嘌呤堿的銀化合物沉淀。
10、 另取一支試管B，加入水解液1ml，三氯化鐵濃鹽酸溶液2ml和地衣酚乙醇溶液0.2ml（約4滴），混勻，用試管夾夾好后放到沸水浴中3~5min，注意觀察溶液是否變成綠色，說明核糖的存在。
11、 再取一支試管C，加入水解液1ml和定磷試劑1ml，混勻，在沸水浴中加熱，注意觀察溶液顏色的變化，溶液變藍，說明磷酸存在。
注意事項：離心管一定要平衡對稱放入離心機中，離心機達到設置轉(zhuǎn)速時才能離開。
四、 實驗結(jié)果
第6步中離心管底部有不少的RNA沉淀。
試管A：出現(xiàn)白色渾濁現(xiàn)象。有嘌呤堿存在。
試管B：加熱后，出現(xiàn)鮮綠色，且隨著加熱時間延長，顏色越來越深。有核糖存在。
試管C：加熱后，出現(xiàn)藍色，且隨著加熱時間延長，顏色越來越深。有磷酸存在。
說明RNA的組分中有嘌呤堿、核糖、磷酸。
分析：
本實驗選用酵母，是因為酵母中RNA含量較多，且價格便宜。RNA可溶于堿性溶液，所以本實驗用0.04mol/LNaOH溶液來提取。RNA不溶于乙醇，可用酸性乙醇使RNA從溶液中沉淀出來，再用乙醇洗滌沉淀，可得到RNA粗制品。
研磨和NaOH使酵母細胞破裂，RNA主要存在于細胞質(zhì)中，所以RNA被釋放出來，同時，NaOH使蛋白質(zhì)變性。
加入酸性乙醇，一方面可以中和NaOH，另一方面，使RNA從溶液中沉淀下來。
RNA含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸等組分，加入硫酸煮沸可使其水解，從水解液中可以測出上述組分的存在。
（1）強酸使核酸分子的有機磷消化為無機磷，使之與鉬酸銨結(jié)合成磷鉬酸銨（黃色沉淀）
PO43- + 3NH4+ + 12MoO42- + 24H+ ===(NH4)3PO4.12MoO3.6H2O + 6H2O
當有還原劑（如維生素C）存在時，Mo6+被還原成Mo4+，再與試劑中的其它MoO42-結(jié)合成Mo（MoO4）2，呈藍色，稱鉬藍。所以試管C中會出現(xiàn)藍色。
（2）RNA與硫酸共熱，生成的核糖進而脫水轉(zhuǎn)化為糠醛，三氯化鐵作為催化劑，可與地衣酚反應，生成綠色化合物，所以試管B中出現(xiàn)綠色。（OR苔黑酚）
（3）嘌呤堿可與硝酸銀反應產(chǎn)生白色的飄零銀化合物沉淀。所以試管A中出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。
（4）不檢測嘧啶堿，是因為與嘌呤堿相比，它難以被水解下來，同時它難檢測且現(xiàn)象不明顯。
擴展資料：
酵母核酸提取原理
提取和制備RNA 的首要問題是選RNA 含量高的材料。微生物是工業(yè)上大量生產(chǎn)核酸的原料，其中RNA 的提制以酵母最為理想，因為酵母核酸中主要是RNA（2.67～10.0%），DNA 很少（0.03～0.516%），而且菌體容易收集，RNA 也易于分離。
RNA 提制過程首先要使RNA 從細胞中釋放，并使它和蛋白質(zhì)分離，然后將菌體除去。再根據(jù)核酸在等電點時溶解度最小的性質(zhì)，將pH 調(diào)至2.0～2.5，使RNA 沉淀，進行離心收集。然后運用RNA 不溶于有機溶劑乙醇的特性，以乙醇洗滌RNA 沉淀。
提取RNA 的方法很多，在工業(yè)生產(chǎn)上常用的是稀堿法和濃鹽法。濃鹽法是在加熱的條件下，利用高濃度的鹽改變細胞膜的透性，使RNA 釋放出來，此法易掌握，產(chǎn)品顏色較好。
使用濃鹽法提出RNA 時應注意掌握溫度，避免在20～70℃之間停留時間過長，因為這是磷酸二酯酶和磷酸單酯酶作用的溫度范圍，會使RNA 因降解而降低提取率。在90～100℃條件下加熱可使蛋白質(zhì)變性，破壞磷酸二酯酶和磷酸單酯酶，有利于RNA 的提取。
掃我聯(lián)系